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【資料圖】

清華大學生命科學學院李雪明課題組在《Journal of Structural Biology》期刊發(fā)表了題為“Locating cellular contents during cryoFIB milling using cellular secondary-electron imaging”的研究論文。該論文利用細胞二次電子成像（CESI）技術(shù)，解決了聚焦離子束(FIB)切割樣品中的定位問題（圖1）。該技術(shù)基于雙束電鏡中掃描電鏡基本的成像方式，無需額外的設備，樣品也無需經(jīng)過任何處理即可實現(xiàn)。該工作討論了CSEI技術(shù)的成像原理，優(yōu)化了CSEI的成像設置，使其可在主流的雙束電鏡上應用，并且經(jīng)過測試，該方法在不同的切割條件下都是可信賴的。

圖1：CESI技術(shù)的工作流程

冷凍電子斷層成像技術(shù)（cryoET）是一項受到廣泛關(guān)注地可以直接在組織或者細胞原位研究生物大分子結(jié)構(gòu)的技術(shù)。FIB因能夠提供近乎無損的樣品減薄方式而成為了cryoET最常用的樣品制備方法。然而，如何在FIB減薄樣品的過程中定位目標區(qū)域一直是一個難題。

研究團隊針對FIB減薄樣品過程中的定位問題，想要開發(fā)一種容易操作、普適性的方法。受到層掃技術(shù)的啟發(fā)，研究團隊想到利用掃描電鏡所成的高襯度的圖像進行定位。在冷凍狀態(tài)下，掃描電鏡主要利用二次電子進行成像，在默認狀態(tài)下，二次電子像被用來觀察樣品的形貌（圖2a），輔助切割。而對于FIB切割出來的平面，二次電子像只能看到模糊的細菌輪廓（圖2b）。為此，該工作對于二次電子像的成像原理進行探究，并對影響二次電子像成像的因素進行了一一測試，包括電壓加速、電流、探測器、成像模式、駐留時間、工作距離、掃描次數(shù)等。最終，總結(jié)出了在市面上主流FIB中都適用的參數(shù)，使得不同儀器上的二次電子像都能有很好的襯度（圖3）。

圖2：默認狀態(tài)下利用掃描電鏡觀察樣品形貌（左）與FIB減薄后的平面（右）

圖3：大腸桿菌細胞使用不同F(xiàn)IB設備成細胞二次電子像均能有很好的襯度

為了驗證利用CESI技術(shù)進行定位的可行性，該工作將CESI技術(shù)應用到不同類型的樣品上，包括細菌、單細胞真核生物衣藻、人皮膚鱗癌細胞、海拉細胞、和動、植物組織（圖4），發(fā)現(xiàn)均能有很好的成像效果。同時，研究團隊發(fā)現(xiàn)，在不同切割的條件下，包括在樣品表面有冰渣的情況下以及大束流的切割條件下，不會影響CSEI技術(shù)的使用。

圖4：不同類型的樣品在CSEI技術(shù)下的成像效果

最后，該研究以衣藻的基體（basal body）為定位對象，建立了簡單的切割-定位流程。使用CSEI技術(shù)定位時，從樣品單側(cè)進行減薄，每次FIB減薄后，都使用CSEI技術(shù)進行定位。CSEI技術(shù)可以實現(xiàn)在切割過程中進行持續(xù)實時成像和精確三維定位。

清華大學生命科學學院李雪明副教授為本文通訊作者。清華大學生命科學學院2018級博士生林超（已畢業(yè)）、生命學院博士后張立、生命學院2021級博士生張子穎、蔡司顯微鏡北京客戶中心工程師蔣藝豐為該論文的共同第一作者。清華大學博士研究生王思涵（已畢業(yè)），清華大學周珩博士、趙雅嫻博士，潘俊敏教授實驗室博士研究生王正茂，李丕龍副教授實驗室李如博士為本工作提供了細胞樣品；李曉敏博士和李英博士為樣品制備和數(shù)據(jù)收集提供的大力支持。本工作得到了國家自然科學基金、清華-北大生命科學聯(lián)合中心、北京生物結(jié)構(gòu)前沿中心和結(jié)構(gòu)生物學高精尖創(chuàng)新中心的資助。

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